Single-cell time course analysis of metabolic switching in inducible gene regulatory networks

Die Optimierung der Zuckerverwertung ist für Bakterien insbesondere unter variablen Umweltbedingungen essentieller Teil ihrer Überlebensstrategien. Bei zwei konkurrierenden und fluktuierenden Nahrungsangeboten stellt sich die Frage, ob eine homogene oder heterogene Anpassung optimal ist. Um solche Anpassungsmechanismen zu verstehen, wurde metabolisches Schaltverhalten anhand von Genexpression mit Hilfe von Reportergenen sowie zeitaufgelöster Fluoreszenz-Mikroskopie auf Einzelzellebene in Escherichia coli untersucht. Da Genexpression ein inhärent stochastischer Prozess ist, können ausgeprägte Unterschiede zwischen einzelnen Zellen auftreten. Diese Expressionsunterschiede können Teil komplexer Überlebensstrategien sein. In dieser Arbeit wird das Schaltverhalten in Antwort auf eine Nährstoffänderung in direkter bakterieller Umgebung sowie das Umschalten zwischen verschiedenen Verwertungsstrategien als Reaktion auf die Zugabe zweier unterschiedlicher Nährstoffe in verschiedenen Konzentrationen analysiert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird das Schaltverhalten im Arabinose-Verwertungssystem untersucht. Hier wurde gezeigt, dass das Abschalten der Genexpression nach Entfernen der induzierend wirkenden Arabinose in allen Zellen innerhalb kurzer Zeit, also homogen abläuft, im Gegensatz zum heterogenen Anschalten. Da die Genexpression in induzierbaren Zuckerverwertungssystemen stark vom Wert der intrazellulären Konzentration des induzierenden Zuckers abhängt, muss zum Abschalten der Genexpression dieser Konzentrationswert unter das zur Induktion nötige Niveau sinken. Ein Absinken der internen Zuckerkonzentration kann entweder über Abbau oder Export des Zuckers geschehen. Innerhalb der hier möglichen Zeitauflösung wurde mit Hilfe einer Mutante, der das Abbauenzymgen araBAD fehlt, keine Abhängigkeit des zeitlichen Abschaltverhaltens von diesem Enzym gefunden. Zusätzlich ist das Abschalten unabhängig von der Expression eines potenziellen Exportproteins des Arabinosesystems. Daher ist möglicherweise ein bisher unbekannter nicht-kanonischer Abbau- oder Exportweg für das schnelle und homogene Abschalten der Genexpression verantwortlich. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Schaltverhalten im Phosphotransferase System, das die Aufnahme zahlreicher Zucker an die Verfügbarkeit von Phosphorgruppen innerhalb der Zelle koppelt. Erstmals wurden quantitative Messungen zum Schaltverhalten des PTS für zwei ausgewählte Zuckerverwertungssysteme, N-acetyl-glucosamine (NAG) und Sorbitol, durchgeführt. Der konkurrierende Prozess um die importlimitierende Ressource Phosphor wurde durch Messung der Genexpression der Systeme sowie durch den konzentrationsabhängigen Einfluss der Zucker auf die Wachstumsrate analysiert. Abhängig von der externen NAG Konzentration zeigten sich zwei Verhaltensweisen: Hohe NAG Konzentrationen führen zu hierarchischem Verwerten der Zucker in Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen, bei niedrigen Konzentrationen hingegen werden die metabolischen Gene beider Systeme simultan angeschaltet. Mit Hilfe eines mathematischen Modells, das asymmetrische Zuckerqualität sowie variable Kopplung implementiert, kann das gemessene Phasendiagramm der Genexpression reproduziert werden. Daher ist es plausibel, dass die simultane Expression der beiden Systeme unter Bedingungen eines nicht-limitierenden Phosphorflusses von einer Entkopplung der Zuckerverwertungssysteme rührt. Die Tatsache, dass die Zellen für das PTS zwei Schaltverhalten kennen, weist auf eine effiziente Regulation mittels Beschränkung des Phosphorflusses hin und könnte insbesondere bei der Anpassung der metabolischen Überlebensstrategie einer Zelle an vorherrschende Umweltbedingungen ebenso von Nutzen sein wie ein schnelles Abschalten der Genexpression nach Entfernen der externen Arabinose

Single-cell time course analysis of metabolic switching in inducible gene regulatory networks

Die Optimierung der Zuckerverwertung ist für Bakterien insbesondere unter variablen Umweltbedingungen essentieller Teil ihrer Überlebensstrategien. Bei zwei konkurrierenden und fluktuierenden Nahrungsangeboten stellt sich die Frage, ob eine homogene oder heterogene Anpassung optimal ist. Um solche Anpassungsmechanismen zu verstehen, wurde metabolisches Schaltverhalten anhand von Genexpression mit Hilfe von Reportergenen sowie zeitaufgelöster Fluoreszenz-Mikroskopie auf Einzelzellebene in Escherichia coli untersucht. Da Genexpression ein inhärent stochastischer Prozess ist, können ausgeprägte Unterschiede zwischen einzelnen Zellen auftreten. Diese Expressionsunterschiede können Teil komplexer Überlebensstrategien sein. In dieser Arbeit wird das Schaltverhalten in Antwort auf eine Nährstoffänderung in direkter bakterieller Umgebung sowie das Umschalten zwischen verschiedenen Verwertungsstrategien als Reaktion auf die Zugabe zweier unterschiedlicher Nährstoffe in verschiedenen Konzentrationen analysiert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird das Schaltverhalten im Arabinose-Verwertungssystem untersucht. Hier wurde gezeigt, dass das Abschalten der Genexpression nach Entfernen der induzierend wirkenden Arabinose in allen Zellen innerhalb kurzer Zeit, also homogen abläuft, im Gegensatz zum heterogenen Anschalten. Da die Genexpression in induzierbaren Zuckerverwertungssystemen stark vom Wert der intrazellulären Konzentration des induzierenden Zuckers abhängt, muss zum Abschalten der Genexpression dieser Konzentrationswert unter das zur Induktion nötige Niveau sinken. Ein Absinken der internen Zuckerkonzentration kann entweder über Abbau oder Export des Zuckers geschehen. Innerhalb der hier möglichen Zeitauflösung wurde mit Hilfe einer Mutante, der das Abbauenzymgen araBAD fehlt, keine Abhängigkeit des zeitlichen Abschaltverhaltens von diesem Enzym gefunden. Zusätzlich ist das Abschalten unabhängig von der Expression eines potenziellen Exportproteins des Arabinosesystems. Daher ist möglicherweise ein bisher unbekannter nicht-kanonischer Abbau- oder Exportweg für das schnelle und homogene Abschalten der Genexpression verantwortlich. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Schaltverhalten im Phosphotransferase System, das die Aufnahme zahlreicher Zucker an die Verfügbarkeit von Phosphorgruppen innerhalb der Zelle koppelt. Erstmals wurden quantitative Messungen zum Schaltverhalten des PTS für zwei ausgewählte Zuckerverwertungssysteme, N-acetyl-glucosamine (NAG) und Sorbitol, durchgeführt. Der konkurrierende Prozess um die importlimitierende Ressource Phosphor wurde durch Messung der Genexpression der Systeme sowie durch den konzentrationsabhängigen Einfluss der Zucker auf die Wachstumsrate analysiert. Abhängig von der externen NAG Konzentration zeigten sich zwei Verhaltensweisen: Hohe NAG Konzentrationen führen zu hierarchischem Verwerten der Zucker in Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen, bei niedrigen Konzentrationen hingegen werden die metabolischen Gene beider Systeme simultan angeschaltet. Mit Hilfe eines mathematischen Modells, das asymmetrische Zuckerqualität sowie variable Kopplung implementiert, kann das gemessene Phasendiagramm der Genexpression reproduziert werden. Daher ist es plausibel, dass die simultane Expression der beiden Systeme unter Bedingungen eines nicht-limitierenden Phosphorflusses von einer Entkopplung der Zuckerverwertungssysteme rührt. Die Tatsache, dass die Zellen für das PTS zwei Schaltverhalten kennen, weist auf eine effiziente Regulation mittels Beschränkung des Phosphorflusses hin und könnte insbesondere bei der Anpassung der metabolischen Überlebensstrategie einer Zelle an vorherrschende Umweltbedingungen ebenso von Nutzen sein wie ein schnelles Abschalten der Genexpression nach Entfernen der externen Arabinose

Single Cell Kinetics of Phenotypic Switching in the Arabinose Utilization System of E. coli

Inducible switching between phenotypes is a common strategy of bacteria to adapt to fluctuating environments. Here, we analyze the switching kinetics of a paradigmatic inducible system, the arabinose utilization system in E. coli. Using time-lapse fluorescence microscopy of microcolonies in a microfluidic chamber, which permits sudden up-and down-shifts in the inducer arabinose, we characterize the single-cell gene expression dynamics of the araBAD operon responsible for arabinose degradation. While there is significant, inducer-dependent cell-to-cell variation in the timing of the on-switching, the off-switching triggered by sudden removal of arabinose is homogeneous and rapid. We find that rapid off-switching does not depend on internal arabinose degradation. Because the system is regulated via the internal arabinose level sensed by AraC, internal arabinose must be rapidly depleted by leakage or export from the cell, or by degradation via a non-canonical pathway. We explored whether the poorly characterized membrane protein AraJ, which is part of the arabinose regulon and has been annotated as a possible arabinose efflux protein, is responsible for rapid depletion. However, we find that AraJ is not essential for rapid switching to the off-state. We develop a mathematical model for the arabinose system, which quantitatively describes both the heterogeneous on-switching and the homogeneous off-switching. The model also predicts that mutations which disrupt the positive feedback of internal arabinose on the production of arabinose uptake proteins change the heterogeneous on-switching behavior into a homogeneous, graded response. We construct such a mutant and confirm the graded response experimentally. Taken together, our results indicate that the physiological switching behavior of this sugar utilization system is asymmetric, such that off-switching is always rapid and homogeneous, while on-switching is slow and heterogeneously timed at sub-saturating inducer levels

Single-cell characterization of metabolic switching in the sugar phosphotransferase system of Escherichia coli

The utilization of several sugars in Escherichia coli is regulated by the Phosphotransferase System (PTS), in which diverse sugar utilization modules compete for phosphoryl flux from the general PTS proteins. Existing theoretical work predicts a winner-take-all outcome when this flux limits carbon uptake. To date, no experimental work has interrogated competing PTS uptake modules with single-cell resolution. Using time-lapse microscopy in perfused microchannels, we analyzed the competition between N-acetyl-glucosamine and sorbitol, as representative PTS sugars, by measuring both the expression of their utilization systems and the concomitant impact of sugar utilization on growth rates. We find two distinct regimes: hierarchical usage of the carbohydrates, and co-expression of the genes for both systems. Simulations of a mathematical model incorporating asymmetric sugar quality reproduce our metabolic phase diagram, indicating that under conditions of nonlimiting phosphate flux, co-expression is due to uncoupling of both sugar utilization systems. Our model reproduces hierarchical winner-take-all behaviour and stochastic co-expression, and predicts the switching between both strategies as a function of available phosphate flux. Hence, experiments and theory both suggest that PTS sugar utilization involves not only switching between the sugars utilized but also switching of utilization strategies to accommodate prevailing environmental conditions

Single-cell switching dynamics from the off- to the on state in the wildtype <i>ara</i> system.

<p>Bacteria of strain MG1655 were induced with 0.5%, 0.05% or 0.01% arabinose at t = 0 min. The image panels show time series of fluorescence images (A, B, C, scale bar: 5 µm). The single cell fluorescence trajectories (D, E, F) show that fluorescence remains negligible until the so-called delay time at which a strong increase starts. Experimental data points are highlighted by red circles and the corresponding fits are shown as red lines. With decreasing arabinose concentration the delay time increases and varies more significantly between bacteria in a population. This effect is shown quantitatively by the distributions of delay times over the populations (G, H, I), which were extracted by fitting a mathematical function describing the gene expression process. Note that at 0.01% arabinose a significant percentage of the bacteria did not switch on the <i>ara</i> system within the experimental observation window. Number of evaluated cells: 63 (0.5% ara), 74 (0.05% ara), 113 (0.01% ara).</p

Scheme of the arabinose utilization system in <i>E. coli</i>.

<p>Arabinose is imported via the arabinose transporters AraE and AraFGH. If the intracellular arabinose level is sufficiently large, arabinose binds the transcriptional regulator AraC. This complex activates the promoters P<i>_E</i>, P<i>_FGH</i>, P<i>_BAD</i> and P<i>_J</i>, driving expression of <i>araE</i>, <i>araFGH</i>, <i>araBAD</i> and <i>araJ</i>, respectively. The latter two operons encode proteins for arabinose catabolism (AraBAD) and a putative arabinose efflux pump (AraJ). The negative autoregulation of AraC resulting in homeostatic control of its own level is not shown explicitly. Arrows indicate arabinose transport and positive regulation, whereas the T-shaped arrow indicates arabinose metabolization.</p

Mean and standard deviation of delay time τ_d and protein expression rate α_p distribution.

<p>Mean and standard deviation of delay time τ_d and protein expression rate α_p distribution.</p

Single-cell response dynamics of the <i>ara</i> system upon arabinose down-shift.

<p>Initially, cells of strain MG1655 (A, native <i>ara</i> regulation), BW25113 (B, Δ<i>araBAD</i>) and JW0386-1 (C, Δ<i>araBAD</i> and Δ<i>araJ</i>) containing the reporter plasmid pBAD24-GFP (<i>gfpmut3</i> under the control of the P<i>_BAD</i> promoter) were prepared in the on-state by induction with 0.5% arabinose for 40 min. At this time arabinose was removed by flushing the microfluidic channel with fresh medium without arabinose. (<i>upper panels</i>) Black lines are experimental fluorescence trajectories, the red circles highlight the data for representative cells, and the bold red lines correspond to the corresponding fits by the model [Eqs. (1)–(7)] under pulsed addition of arabinose. FU: fluorescence units. (<i>lower panels</i>) Red lines show the corresponding dynamics of P<i>_BAD</i> promoter activities in individual cells as inferred from the model. Number of evaluated cells: 62 (strain MG1655), 55 (strain BW25113), 51 (strain JW0386-1). For corresponding dynamics without arabinose removal see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0089532#pone.0089532.s003" target="_blank">Fig. S3</a>.</p